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International Poster Journal of Dentistry and Oral Medicine
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Int Poster J Dent Oral Med 11 (2009), No. 3     15. Sep. 2009

Int Poster J Dent Oral Med 2009, Vol 11 No 3, Poster 451

Verhalten präformierter Fibrinmembranen für ein rein autologes Bone Tissue Engineering

Sprache: Deutsch
 

Autoren: Dr. Tim Nolting, Jörg Wünnenberg, Prof. Dr. Dr. Dr.h.c. Ulrich Joos, Prof. Dr. Dr. Johannes Kleinheinz,
Abteilung für Mund- und Kiefer-Gesichtschirurgie, Universität Münster

Datum/Veranstaltung/Ort:
14.-17.5.2008
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Mund-Kiefer-Gesichtschirurgie
Münster
 

Einleitung

Autologer Knochen gilt auch heute noch als Knochenersatzmaterial der ersten Wahl zur Regeneration knöcherner Defekte. Der Vorteil der Osteokondukivität und -induktivität wird jedoch nachteilig beeinflusst durch das limitierte Angebot und die erhöhte Spendermorbidität. Die erfolgreiche Integration extrakorporal erzeugter Gewebeimplantate in einen knöchernen Defekt benötigt eine optimale Zusammensetzung der Gewebe-Matrix sowie darin enthaltener spezifischer Gewebszellen. Für den Knochen bedeutet dies, eine Struktur zu finden, die der natürlichen kollagenen Struktur entspricht und die die Kultivierung und die Anzüchtung von allen für die Osteogenese entscheidend benötigten Zellen, insbesondere von Endothelzellen, ermöglicht.
 

Problemstellung

Ziel der Studie war es, durch Tissue Engineering einer primär vaskularisierten Implantatkonstruktion auf Basis einer Fibrin-Matrix eine schnellere und funktionellere Ausheilung so genannter "Critical size defects" (CSD) zu erreichen und dabei ausschließlich autologe Zellen und Gewebsanteile zu verwenden.
 

Material und Methoden

Aus dem venösem Citratblut Göttinger Minischweine wurde eine autologe Fibrin-Matrix hergestellt. Diese Membran wurde mittels Modified Critical Point Dry (MCPD) - Methode aufbereitet und bei -20°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
Aus dem Periost der Schädelkalotte der Versuchtiere wurden Osteoblasten, aus Jugularvenen der Tiere Endothelzellen nach Standardverfahren gewonnen und angezüchtet. Beide Zelltypen wurden auf 5mm große und 1mm dicke Fibrinscheiben ausgesiedelt, die vorher bei 20°C für 15 Minuten unter sterilen Kautelen aufgetaut wurden.
Die Adhäsion (Fibronectin, VE-Cadherin), die Proliferation (Auszählung) und zelluläre Differenzierung (von - Willebrand - Faktor, Osteocalcin) wurde in vitro histologisch, immunhistologisch und ultrastrukturell untersucht.
Je 3 Scheiben der auf diese Weise autolog hergestellten Implantatteile wurden sandwichartig in vivo in definierte 5 mm breite und 7 mm tiefe CSD im Corpus mandibulae der Versuchtiere eingebracht. Die knöcherne Regeneration wurde zu definierten Zeitpunkten von 3, 7, 14 Tage nach Sacrifizierung der Tiere ebenfalls histologisch, immunhistologisch und ultrastrukturell ausgewertet.

Abb. 1: Herstellung Fibrinmembran Abb. 2: Ungetrocknete Fibrinmembran
Abb. 3: MCPD-Fibrinmembran aufgetaut in NaCL Abb. 4: MCPD-Fibrinmembran (Schnitt-/Nahtversuch)
Abb. 5: MCPD-Fibrinmembran (Handling)
 

Ergebnisse

Für beide Zellreihen zeigte sich in vitro eine ausgeprägte Adhäsion auf der Matrix wenige Stunden nach Aussiedelung und eine hohe Proliferationsrate mit Ausbildung konfluierender Zellschichten nach 3 Tagen. Die Differenzierungsmarker wiesen für die Osteoblasten eine gesteigerte Expressionsrate extrazellulärer Matrixproteine auf, die Endothelzellen bildeten nach Konfluenz und Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten zyklische Strukturen aus. Die in vivo Versuche ergaben eine gesteigerte, dichtere Regeneration im Bereich der knöchernen Defekte. Nach 3 Tagen waren ausgeprägte kapilläre Einsprossungen in die Matrix, nach 7 Tagen erste Mineralisationskeime im Fibrin-Netzwerk nachweisbar. Nach 14 Tagen nach Implantation zeigte sich eine fast vollständig Osteoneogenese im Bereich der Critical size defects. Die knöcherne Regeneration der Defekte breitet sich, im Vergleich zu den Kontrollen signifikant doppelt so schnell aus.

Abb. 6: MCPD-Fibrinmembran (REM) Abb. 7: MCPD-Fibrinmembran (HE,10x)
Abb. 8: Osteoblasten auf MCPD-Fibrinmembran (ON, 20x) Abb. 9: Osteoblasten auf MCPD-Fibrinmembran (REM)
Abb. 10: Endothelzellen auf MCPD-Fibrinmembran (vWF,63x) Abb. 11: Endothelzellen auf MCPD-Fibrinmembran (REM)
Abb. 12: Implantationsbeispiel am Schweinekiefer Abb. 13: Kapilläre Eionsprossung 3 Tage post implantationem (Masson-Goldner, 40x)
Abb. 14: Knöcherne Regeneration 14 Tage post implantationem (HE, 20x)
 

Schlußfolgerungen

Fibrin stellt somit eine ideale Grundmatrix für das rein autologe Bone Tissue Engineering dar mit deutlichen Vorteilen im Zellverhalten und bei der Inkorporation in den Defekt gegenüber Alternativkonstrukten.
 

Literatur

  1. Aper T, Teebken OE, Haverich A (2004) Use of fibrin preparation in the engineering of a vascular graft model. Eur J Vasc Endovasc Surg 28(3);296-302
  2. Bollinger-Stucki B, Baillod P, Mader W, Furlan M (2000) Biochemical Properties of the Fibrinogen Component of a Fibrin Glue Before and After Severe Dry Heat Treatment. Appl Biomater 53;577-83
  3. Bootle-Wilbraham CA, Tazzyman S, Stirk CM, Lewis CE (2001) Fibrin Fragment E stimulates the proliferation, migration and differentiation of human microvascular endothelial cells in vitro. Angiogenesis 4;269-75
  4. Carmeliet P (2000) Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine Vol 6(3):389-95
  5. Carr ME, Carr SL (1995) Fibrin structure and concentration alter clot elastic modulus but do not alter platelet mediated force development. Blood Coagul Fibrinolysis 6; 79-86
  6. Frerich B, Lindemann N, Kurtz-Hoffmann J, Franke RP (1999). Engineering of vascular tissues. Clin Hemorheol Microcirc 20:3
  7. Groger A, Merten HA, Holste J, Sittinger M (2003) Tissue engineering of bone for mandibular augmentation in immunocompetent minipigs: preliminary study. Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg 37(3):129-3
     

Dieses Poster wurde übermittelt von Dr. Tim Nolting.
 

Korrespondenz-Adresse:
Dr. Tim Nolting
Universität Münster
Abteilung für Mund- und Kiefer-, Gesichtschirurgie
Waldeyerstr. 30
48149 Münster