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International Poster Journal of Dentistry and Oral Medicine
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Int Poster J Dent Oral Med 7 (2005), No. 4     15. Dec. 2005

Int Poster J Dent Oral Med 2005, Vol 7 No 04, Poster 295

Nachweis und Quantifizierung von Parodontitis-assoziierten Sulfat reduzierenden Bakterien (SRB) mittels quantitativer PCR

Sprache: Deutsch

Autoren:
cand. med. dent. Sebastian Becher
Lehrstuhl und Abteilung für Parodontologie, Fakultät für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Universität Witten/Herdecke

Dr. Veronika Homann
Abteilung für Epithelphysiologie, Max Planck-Institut Dortmund

Dr. (Syr) Firass Shihabi
Lehrstuhl und Abteilung für Parodontologie, Fakultät für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Universität Witten/Herdecke

Univ.-Prof. Dr. Wolf-D. Grimm
Lehrstuhl und Abteilung für Parodontologie, Fakultät für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde, Universität Witten/Herdecke

Datum/Veranstaltung/Ort:
13.-14. Januar 2005
37. Jahrestagung der Arbeitsgemeinschaft für Grundlagenforschung (AfG) in der DGZMK
Mainz

Einleitung

1895 berichtete W. M. Beijerick erstmals über die Isolation von Sulfat reduzierenden Bakterien aus einem Kanal in den Niederlanden. Sulfat reduzierende Bakterien sind in der Lage unter strikt anaeroben Bedingungen Sulfat, Schwefelgemische oder elementaren Schwefel, die als Elektronenakzeptoren dienen, dissimilatorisch in Schwefelwasserstoff zu reduzieren. Schwefelwasserstoff wirkt toxisch durch Inaktivierung der Zytochromoxidase. Dieser Prozess wird ebenfalls als Sulfatatmung bezeichnet. 1995 wurde schließlich erstmals dann das Vorkommen von Sulfat reduzierenden Bakterien im subgingivalen Biofilm parodontaler Taschen beschrieben (van der Hoeven et al.1995). Weitere Untersuchungen zeigen, dass SRB bei gesunden Probanden in 10% der Fälle nachzuweisen war. Bei Parodontitispatienten zeigte sich dagegen ein Anstieg der SRB-Prävalenz auf 58-72%. In Pilotstudien konnte unsere Forschungsgruppe eine positive Korrelation zwischen der klinischen Taschentiefe und der SRB-Prävalenz nachweisen(Grimm et al., 2000, 2003, 2004).

Problemstellung

Ziel unserer Untersuchungen ist, das Vorkommen von zwei SRB-Stämme mittels quantitativer PCR bei Parodontitis-Patienten nach systematischer Parodontitis-Therapie in der Phase der parodontalen Erhaltungstherapie (SPT) nachzuweisen.

Material und Methoden

An der klinisch-kontrollierten Studie nahmen 15 Patienten teil.

Plaque-Isolate:

Die Plaqueisolate wurden mittels der Entnahmetechnik nach SLOTS subgingival vor der SPT entnommen und nach 3 sowie 6 Monaten erfolgte die erneute Entnahme. Die Papierspitzen wurden hier 20 sec. In ausgewählten Sulci belassen und darauf in sterile Glasröhrchen zur Lagerung überführt.

DNA Extraktion:

Die Papierspitzen wurden jeweil in 1ml DPBS aufgenommen und 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Darauf erfolgte die Entnahme der Papierspitzen und die Zentrifugation bei 10000rpm für 20 min. sowie das anschließende Lösen des Bakterienpellets in 200µl DPBS. Die Extraktion erfolgte mittels dem High Pure PCR Template Preperation Kit (Roche) entsprechend den Angaben des Herstellers.

PCR:

Die Amplifikation der 16S rDNA (350 bp) von D. orale erfolgte mittels qualitativer PCR und unter Anwendung von D. orale 16S rDNA spezifischen Primern. Pro PCR Ansatz wurden je 1 µl Primer (20 pmol), 1 µl dNTPs (10mM), 50 µl 10x reaction buffer, 0,25 µl Taq-Polymerase (5U/µl) und 20µlDNA bzw 20µl H2O (Wasserkontrolle) zugefügt. Es wurden 35 Zyklen mit einer Annealingtemperatur von 56,9 °C durchlaufen.

Abb.1: TEM-Darstellung einer negativ angefärbten Zelle eines Desulfomicrobium orale sp. Nov., NY 678 (DSM1238). Die Balkengröße entspricht 1 Mikrometer (aus: P.Langendijk-Genevaux, 2001) Abb.2: Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion

 

Klonierung der PCR-Fragmente:

Die Klonierung der PCR Fragmente geschah unter Verwendung des TOPO- pCR2.1-Cloning Kits von Invitrogen gemäß den Angaben des Herstellers. In unserem Versuch verwendeten wir die One Shot Chemical Transformation Methode. Nach blau-weiß Selektion erfolgte die Anzucht einzelner weißer Kolonien in je 2ml LB-Amp-Medium (2µl Amp/ml LB). Die Anzucht erfolgte bei über Nacht Inkubation bei 37 °C. Die anschließende Minipräparation der Plasmid DNA erfolgte unter Verwendung der Puffer 1-3 (Qiagen).

  • Lösen des zuvor abzentrifugierten Pellets in 300µlP1
  • Zugabe von P2 und anschließender Inkubation von 5 min bei RT
  • Abschließende Zugabe von P3
  • Inkubation auf Eis für 10 min. und Zentrifugation für 10 min. bei 10000 rpm.
  • Fällen der DNA in 500µl Isopropanol und Zentrifugation fü 20 min. bei 15000 rpm.
  • Waschen des Pellets mit 70% EtOH
  • anschließendem Trocknen und Aufnahme in 30µl H20
  • Herausschneiden des in pCR2.1 klonierten PCR Fragmentes durch EcoRI-Restriktion
  • Kontrolle auf einem 1,5% Agarose Gel mit l-HindIII-Marker

Anschließende Sequenzierung des deutlichsten Klons mittels M13 Primern und Abgleich mit der 16S rDNA Sequenz von D. orale.

Quantitative real time PCR:

Die zuvor durch Klonieren gewonnene 16sDNA wurde zur Optimierung der spezifischen real-time Primer und Festlegung eines Standards mittels einer Verdünnungsreihe von 105 -102 mittels dem QuantiTect Probe PCR Kit (Qiagen) im GeneAmp 5700 Sequence Detection System. Es wurde die 2 Step cycling Methode verwendet. Abschließend wurde unter Verwendung der 15 Patientenproben und der SRB spezifischen Primern (D. orale und D.fairfieldensis) die real-time PCR nach derselben Methode durchgeführt. Die Floureszens wurde durch die Verwendung spezifischer TaqMan Sonden erreicht. Das amplifizierte Fragment von D. orale beträgt eine Länge von 85 bp.

Abb. 3: Quantitative Erfassung von D. orale mittels real-time PCR (ein Patient) Rot=base-line grün= 3 Monate blau= 6 Monate Abb. 4: Verdünnungsreihe für Standard von 105 - 102 (D. orale)
Abb. 5: Prinzip der TaqMan Sonde

 

Ergebnisse

Tab. 1: Thermoprofil der real-time PCR am Beispiel von D. orale
Step Time Temperature
UNG Carryover Prevention 2 min 50°C
PCR:
Initial activation Step 15 min 95°C
Two-step-cycling:
Denaturation 15 s 94°C
Annealing/Extension 60 s 58°C
Number of cycles 44

 

Tab. 2: Reaktionskomponenten für die real-time PCR
PCR Master mix 12,5µl
Forward Primer
10pmol/µl
1,0µl
Reverse Primer
10pmol/µl
1,0µl
Template DNA 9,0µl
TAQ Sonde
2,5pmol/µl
1,0µl
UNG
1u/µl
0,5µl

 

Tab. 3: Primersequenzen PCR und qPCR von D. orale
PCR:
Forward: 5'-ATC TGC CCT TGG ATT TGG GAT AA-3'
Reverse: 5'-TGT TGG ACC CGC ACC ACT TC-3'
Real-time PCR:
Forward: 5'-ATC TGC CCT TGG ATT TGG GAT AA-3'
Reverse: 5'-GCA TCC TTT ACC GAC TCC TTT TA-3'
Alle untersuchten Patientenproben (n=15) zeigten über alle
Untersuchungszeiträume ("base-line", 3 Monate, 6 Monate)
einen 100%-igen D. orale-Nachweis.

Schlußfolgerungen

Aus 10 parodontitisspezifischen Isolaten konnten Langendijk et al. [2001] die histologischen, biochemischen und genetischen Eigenschaften dieser SRB bestimmen. Sie wurden dann mit den vorher bekannten SRB-Spezies verglichen. Einer der isolierten SRB-Stämme zeigte morphologisch leicht gekrümmte Bakterienzellen mit einer hohen Motilität. Die spezifischen Schwefel-Redox-Reaktionen verwiesen auf inkomplette Laktat- und Pyruvat-Oxidationen im Vergleich zu equimolaren Mengen von Azetaten. Desulfoviridin und Zytochrom C3 waren in diesem mesophilen Vibriod nachweisbar, während die zellulären Lipid-Profile in Übereinstimmung mit dem Genus Desulfovibrio standen. 16S rDNS-Untersuchungen zeigten eine Übereinstimmung mit den 16S rDNS-Sequenzen der Spezies "Desulfovibrio fairfieldensis". Die Phänotypisierung und die phylogenetische Analyse unterstrichen, daß dieses stäbchenförmige Bakterium, isoliert aus parodonalen Taschen, als ein neuer SRB-Stamm anzusehen ist, für den die Bezeichnung Desulfomicrobium orale vorgeschlagen wurde. Aus den gegenwärtig verfügbaren Publikationen zu den oralen SRB ist abzuleiten, daß die Entwicklung diagnostischer Methoden zum klinischen Nachweis der oralen SRB-Besiedlung neue Möglichkeiten einer parodontologischen Risiko-Diagnostik eröffnet. Die quantitative PCR-Methode ist geeignet, die SRB-Prävalenz bei Parodontitispatienten zu ermitteln.

Literatur

  1. J. S. van der Hoeven, C.W.A. van den Kienboom, M.J.M. Schaeken (1995). Sulphate-reducing bacteria in the periodontal pocket. Oral Microbiol Immunol 10: 288-290,
  2. Langendijk PS, Grimm W-D, van der Hoeven JS (2001). Sulfate-reducing bacteria in relation with other potential periodontal pathogens. J Clin Periodontol 28:1151-1157
  3. W.-D. Grimm, P. Cichon, J. S. van der Hoeven, P. S. Langendijk, F. Smith, M. Worley, L. Schmitz, S. Offenbacher (2000). The influence of sulfate-reducing bacteria colonization of 2 different bioresorbable barrier membranes for GTR. An 18-month case-controlled microbiologic and clinical study. Int J Periodontics Restorative Dent 20(1): 91-9.
  4. W.-D. Grimm, K. Grimm , J. Hagemann, R.C. Williams, J. S. van der Hoeven, P. S. Langendijk-Genevaux, Auftretenshäufigkeit von Sulfat-reduzierenden Bakterien (SRB) bei verschiedenen Parodontitis-Formen. Dtsch Zahnarztl Z, 58(5): 311-315.
  5. Grimm WD, Arnold WH, Grimm K, van der Hoeven JS, Shihabi F, Langendijk-Genevaux PS (2004). Vergleichende In-vitro-Untersuchungen zur Adhäsion von Sulfat-reduzierenden Bakterien (SRB) auf verschiedenen resorbierbaren Barriere-Membranen. Dtsch Zahnärztl Z. 59(11): 626-32.

Abkürzungen

SRB = Sulfat reduzierenden Bakterien
SPT = Supportive Periodontal Treatment

 

Dieses Poster wurde übermittelt von cand. med. dent. Sebastian Becher.

Korrespondenz-Adresse:
Univ.-Prof. Dr. Wolf-D. Grimm
Leiter des Lehrstuhl und Abteilung für Parodontologie Fakultät für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde
Universität Witten/Herdecke
A.-Herrhausen-Str. 50
58 448 Witten
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