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Int Poster J Dent Oral Med 14 (2012), No. 3     15. Sep. 2012

Int Poster J Dent Oral Med 2012, Vol 14 No 3, Poster 612

Il-1 Gencluster und das Auftreten von A. actinomycetemcomitans bei aggressiver Parodontitis

Sprache: Deutsch
 

Autoren:
Dr. Susanne Schulz, Prof. Dr. Hans-Günter Schaller, Dr. Stefan Reichert,
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Poliklinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie, Halle
PD Dr. Jamal M. Stein,
RWTH Aachen, Klinik für Zahnerhaltung, Parodontologie und Präventive Zahnheilkunde, Aachen
Dr. Christiane Gläser,
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Institut für Humangenetik und Medizinische Biologie, Halle

Datum/Veranstaltung/Ort:
15.09.-17.09.2011
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Parodontologie
Baden-Baden, Deutschland
 

Einleitung

IL-1a und 1b, sowie der IL-1 Rezeptor (IL-1R) und der Rezeptorantagonist (IL1-RA) sind wichtige Faktoren im Rahmen der wirtsspezifischen Immunantwort auf Parodontpathogene.
Funktionell bedeutsame genetische Varianten in Genen des IL-1 Genclusters wurden identifiziert und deren Rolle im Rahmen der Pathogenese der Parodontitis beschrieben. Die Ergebnisse sind jedoch widersprüchlich.
Als entscheidender Auslöser entzündlicher Parodontitiden wird die subgingivale Besiedlung mit parodontopathogenen Keimen angesehen. Im Rahmen der Pathogenese der Erkrankung spielt die wirtsspezifische Immunantwort eine zentrale Rolle. Diese wird u.a. duch eine genetische Prädisposition beeinflusst.
Gene des IL-1 Genclusters beeinflussen eine Vielzahl von verschiedenen Zellen (natural killer cells, Makrophagen, TH-Zellen, B-Zellen), deren Bedeutung bei der Manifestation und Progression von entzündlichen Parodontitiden ausführlich beschrieben wurde.
Funktionell wichtige Polymorphismen (SNP) wurden für IL-1a (rs1800587), IL-1b (rs16944, rs1143634), IL-1R (rs2234650), IL-1RA (rs315952) identifiziert.
Kornmann et al. (1997) postulierte einen parodontitisassoziierten "composite genotype" der sich aus den seltenen Genotypen der SNPs rs1800587 (IL-1a) und rs1143634 (IL-1b) zusammensetzt.

 
Abb. 1: Signaltransduktionsweg vermittelt durch Gene des IL-1 Clusters (IL-1a, Il-1b, IL-R, IL-1RA)
 
 

Problemstellung

Das Ziel dieser Studie bestand darin die Bedeutung von SNPs an den o.a. Genorten für das Auftreten von Parodontitiden und subgingivaler Keimbesiedlung nach Adjustierung für etablierte parodontale Kofaktoren zu bestimmen.
 

Material und Methoden

Einschlusskriterien der Patienten

Generalisierte aggressive Parodontitis (AP, n=86):
Erkrankungsbeginn vor dem 35. Lebensjahr
Attachmentverlust > 4mm an mindestens 30% der Zähne
> 3 betroffenen Zähne, keine Inzisivi oder erste Molaren
Missverhältnis zwischen Menge mineralisierter Plaque und Attachmentverlust

Generalisierte chronische Parodontitis (CP, n=73):
Attachmentverlust > 4mm an mindestens 30% der Zähne
Attachmentverlust konsistent zur Akkumulation mineralisierter Plaque

Parodontitisfreie Kontrollprobanden (n=89):
Sondiertiefe < 3.5mm
Kein Attachmentverlust durch Parodontitis (Ausnahmen: Attachmentverlust infolge überkonturierter Restaurationen, primär endodontische Läsionen Putztraumata)

Genomische Untersuchungen

DNA-Isolation
Die DNA-Präparation der genomischen DNA aus humanem venösen EDTA-Blut erfolgte mittels "blood extraction kit" (Quiagen, Hilden).
200µl EDTA-Blut wurden zur Zelllyse mit 20 µl Protease versetzt.
Nach der Zugabe von 200 µl Lysispuffer AL wurde die Probe 15 sec gevortext und für 10 min bei 56°C inkubiert.
200 µl Ethanol wurde zugegeben, der Ansatz gevortext und auf eine Säule (QIAamp Spin Column) gegeben.
Nach 2maligem Waschen (Puffer AW1 und AW2) der an die Säule gebundenen DNA wurde die DNA durch Zentrifugation getrocknet.
Die DNA wurde mit 200µl aqua dest. 5min inkubiert und von der Säule gelöst.

PCR mittels sequenzspezifischer Primer
Die Genotypanalyse der Gene des IL-1 Genclusters erfolgte mit Hilfe des "CYTOKINE Genotyping array CTS-PCR-SSP Tray kits" der "Collaborative Transplant Study", Department of Transplantation Immunology of the University Clinic of Heidelberg.
In jeder PCR wurde ein 440bp-Fragment des humanen CRP-Gens als Positivkontrolle koamplifiziert.
Die PCRs wurden mit Hilfe sequenzspezifischer Primer durchgeführt, die die Detektion der entsprechenden SNPs. Die Primer waren in thin-walled plastic 96-well PCR trays lyophilisiert.
Je PCR wurden 10µl Mastermix, der 1U Taq-Polymerase (Invitek), 100ng genomische DNA, 5% Glycerol und PCR-Puffer enthielt, dazugegeben.
PCR-Programm (2 min 94°C; 10 Zyklen: 15 sec 94°C, 1 min 64°C; 20 Zyklen: 15 sec 94°C, 50 sec 61°C, 30 sec 72°C)
PCR-Produkte wurden im ethidiumbromidhaltigen, 2%igen Agarosegel aufgetrennt und ausgewertet.

Subgingivale Bestimmung von 5 parodontpathogenen Leitkeimen

Probengewinnung und DNA-Isolation
Die Plaqueproben wurden mit sterilen Papierspitzen aus der tiefsten Tasche jedes Quadranten entnommen und gepoolt.
Die bakterielle DNA wurde mittels QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen, Hilden) isoliert.
Die Papierspitzen wurden mit 180 µl ATL-Puffer und 20 µl Pproteinase K für 10min bei 70°C inkubiert.
200 µl Lysispuffer Al wurde hinzugegeben und 5min bei 95°C inkubiert.
Der Ansatz (ohne Filterspitzen) wurde auf eine Säuöe (QIAamp Spin Column) pipettiert und 2 mal mit Puffer AW1 und AW2 gewaschen.
Die DNA wurde in 400µl AE-Puffer gelöst und bei -20°C gelagert.

PCR
Für die spezifische Amplifikation von Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermedia (Pi), Tannerella forsythia (Tf) und Treponema denticola (Td) wurde der micro-Ident® test von HAIN-Diagnostik (Lifesience, Nehren) benutzt. Mastermix (Puffer, biotinylierte Primer, DNA als Positivkontrolle), 2U Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg), und 5 µl der isolierten bakteriellen DNA wurden gemixt.
PCR: 5 min 95°C; 10 Zyklen: 30 sec 95°C, 2 min 58°C; 20 Zyklen: 25 sec 95°C, 40 sec 53°C, 40 sec 70°C; 8 min 70°C
Die PCR-Produkte wurden im ethidiumbromidhaltigen 1%igen Agarosegel aufgetrennt.

Hybridisierung
20 µl des PCR-Produkts und 20 µl der Denaturierungslösung wurden für 5 min inkubiert.
1 ml Hybridisierungspuffer (vorgewärmt auf 45°C) wurde dazugegeben
Gabe dieser Lösung zur Membran, vorhybridisiert mit bakterieller DNA und Positivkontrollen.
Inkubation bei 45°C für 30 min im Schüttelwasserbad.
Membran wurde mit 1 ml "stringent wash solution" bei 45°C für 15 min gewaschen.
1 ml der Konjugatlösung wurde hinzugegeben (Raumtemp., 30 min).
Waschen der Membran und Inkubation mit 1 ml der Substratlösung.
Nachweis der Bakterien erfolgte visuell (Farbreaktion mittels Alkalischer Phosphatase).
2 Positivkontrollen für PCR (AC) und Hybridisierung (CC)) sind im Test enthalten.

 
Abb. 2: Bestimmung der subgingivalen Keimbesiedlung mittels des micro-Ident® Test (HAIN-Diagnostik)
 
 

Ergebnisse

In dieser Fall-Kontroll-Studie konnten weder nach bivariater noch multivariater Analyse Assoziationen zwischen genetischen Varianten des IL-1 Genclusters und dem Auftreten von schweren Parodontitiden gezeigt werden. Träger der seltenen Genotypen der SNPs rs1800587 (pkorr.=0.009), rs1143634 (pkorr.=0.009) und Träger des "composite" Genotyps (rs1800587+rs1143634) (pkorr.=0.031) hatten aber ein zweifach höheres Risiko für eine subgingivale Besiedelung mit A.actinomycetemcomitans. Mit logistischer Regression (forward stepwise) und unter Berücksichtigung der parodontalen Kofaktoren Alter, Geschlecht, Rauchen und approximaler Plaqueindex konnten diese signifikante Assoziationen bestätigt werden.

  Chronische Parodontitis (CP) Aggressive Parodontitis (AP) Parodontitisfreie Kontrollen p Werte vs. Kontrollen
  n = 73 n = 86 n = 89 CP AP
Durchschnittsalter (Jahre) 49.1 ± 9.4 40.4 ± 9.8 46.2 ± 10.8 n.s. < 0.001
Geschlecht (% weibl.) 63.0 64.0 53.3 n.s. n.s.
Raucher 23.6 34.9 21.3 n.s. n.s.
Approximaler Plaqueindex (%) 62.0 ± 25.6 53.3 ± 28.7 47.2 ± 21.4 < 0.001 n.s.
Blutung auf Sondierung (%) 70.6 ± 24.7 78.7 ± 23.2 45.2 ± 23.9 < 0.001 < 0.001
Sondiertiefe (mm) 5.3 ± 1.3 5.7 ± 1.4 2.6 ± 0.7 < 0.001 < 0.001
Clinischer Attachmentverlust (CAL in mm) 6.0 ± 1.5 6.5 ± 1.5 3.0 ± 0.8 < 0.001 < 0.001
 Zähne mit CAL 4-6 mm (%) 45.8 39.5 3.4 < 0.001 < 0.001
 Zähne mit CAL > 6 mm (%) 44.4 57.0 1.1 < 0.001 < 0.001
Frühzeitiger Zahnverlust durch Prodontitis bei Verwandten 40.9 57.0 9.1 < 0.001 < 0.001
Tab. 1: Klinische und demographische Charakterisierung der Probandengruppen
  Chronische Parodontitis (CP) Aggressive Parodontitis (AP) Parodontitisfreie Kontrollen p Werte vs. Kontrollen
  n = 73 n = 86 n = 89 CP AP
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (%) 34.2 40.7 18.0 n.s. 0.001
Porphyromonas gingivalis (%) 87.7 76.7 22.5 < 0.001 < 0.001
Prevotella intermedia (%) 61.6 61.6 31.5 < 0.001 < 0.001
Tannerella forsythia (%) 97.3 86.0 68.5 < 0.001 0.005
Treponema denticola (%) 98.6 86.0 62.9 < 0.001 0.002
Pg, Td, Tf (%) 83.6 69.8 22.5 < 0.001 < 0.001
Tab. 2: Mikrobiologische Untersuchungen der Probandengruppen
Abb. 3a-b : Genetische Untersuchungen: Haplotyp-Blockstruktur (Software: Haploview 4.2)
Abb. 3c-d: Genetische Untersuchungen: Haplotyp-Blockstruktur (Software: Haploview 4.2)

Die SNPs rs1800587 und rs 1143634 befanden sich in allen Probandengruppen in einem starken "linkage disequilibrium" (LOD > 10). Diese Daten sind in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Kornman et al. (1997).

 
Abb. 4: Genetische Untersuchungen: "Composite genotype" (IL-1a, rs1800587 + IL-1b, rs1143634) und A.actinomycemtcomitans bei AP-Patienten  
  AP (n = 86) CP (n = 73) Parodontitisfreie Kontrollen (n = 89)
IL-1α: rs1800587
 CC (%) 54.1 50.0 49.4
 CT+CC (%) 45.9 50.0 50.6
IL-1β: rs16944
 CC (%) 43.0 43.8 40.4
 CT+CC (%) 57.0 56.2 59.6
IL-1β: rs1143634
 CC (%) 62.2 61.1 56.8
 CT+CC (%) 37.8 38.9 43.2
IL-1R: rs2234650
 CC (%) 48.8 42.5 46.1
 CT+CC (%) 51.2 57.5 53.9
IL-1RA: rs315952
 CC (%) 45.3 46.6 40.9
 CT+CC (%) 54.7 53.4 59.1
"Composite genotyp": IL-1α: rs1800587 + IL-1β: rs1143634
Genotypträger von mindestens einem seltenen Allel an jedem SNP (%) 66.7 69.0 59.1
Genotypträger aller weiteren Kombinationen (%) 33.3 31.0 40.9
Tab. 3: Genetische Untersuchungen: Genotype and allele distribution of polymorphsims in IL-1 gene cluster in dependence on the occurrence of AP and CP

Schlußfolgerungen

Obwohl Polymorphismen in den Genen für IL-1a und Il-1b mit dem Auftreten von A. actinomycetemcomitans assoziiert waren, konnten sie weder in bivariaten noc in multivariaten Analysen als Risikoindikatoren für Parodontitis bestätigt werden.
 

Dieses Poster wurde übermittelt von Dr. Susanne Schulz.
 

Korrespondenz-Adresse:
Dr. Susanne Schulz
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Poliklinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie
Harz 42a
06108 Halle