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Int Poster J Dent Oral Med 12 (2010), No. 2     15. June 2010

Int Poster J Dent Oral Med 2010, Vol 12 No 2, Poster 489

Der Einfluss von SNPs im CD14- und TLR4-Gen auf die subgingivale Besiedlung mit Pardontopathogenen

Sprache: Deutsch
 

Autoren:
Dr. Susanne Schulz, Dr. Jana Klapproth, Dr. Uta Zimmermann, Prof. Dr. Hans-Günter Schaller, PD Dr. Stefan Reichert,
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Universitätspoliklinik für Zahnerhlatungskunde und Parodontologie
Yvonne Reichert,
Private Zahnarztspraxis, Halle (Saale)
Dr. med. dent. Jamal M. Stein,
RWTH Aachen, Klinik für Zahnerhaltung und Parodontologie und Präventive Zahnheilkunde
Dr. Christiane Gläser,
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Institut für Humangenetik und Medizinische Biologie

Datum/Veranstaltung/Ort:
05.-07.11.2009
Deutscher Zahnärztetag 2009
München, Deutschland

Poster Award
2. Posterpreis der Deutschen Gesellschaft für Parodontologie

Einleitung

Als ein entscheidender Auslöser entzündlicher Parodontitiden wird die subgingivale Besiedlung mit parodontopathogenen Bakterien angesehen. Bei der nachfolgenden Immunantwort spielen CD14 und Toll like receptor 4 (TLR4) als Rezeptoren für bakterielle LPS-LBP-Komplexe eine wichtige Rolle. Funktionell wichtige Polymorphismen wurden für beide Gene beschrieben:

CD14: c.-159C>T, TT-Genotyp erhöht die CD14-Transkriptionsrate, Hubacek et al., 1999
TLR4: Asp299Gly, Gly-Allel mit verminderter LPS-Sensibilität assoziiert, Rhallabandi et al.., 2006
Thr399Ile, Ile-Allel mit verminderter LPS-Sensibilität assoziiert, Rhallabandi et al., 2006

Abb. 1 und 2: CD14 und TLR4 als Rezeptoren des Immunsystems
 

Problemstellung

Ziel der Studie: In der vorliegenden Studie sollte ein möglicher Zusammenhang zwischen den Polymorphismen im CD14- sowie TLR4-Genen und dem Auftreten von chronischer (CP) und/oder aggressiver (AP) Parodontitis untersucht werden. Darüber hinaus sollten mögliche Assoziationen zur subgingivalen Keimbesiedlung (Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A.a.), Porphyromonas gingivalis (P.g.), Prevotella intermedia (P.i.), Tannerella forsythensis (T.f.), Treponema denticola (T.d)). Die Assoziationsuntersuchungen wurden unter Berücksichtigung weiterer Kofaktoren für Parodontitis durchgeführt.
 

Material und Methoden

Einschlusskriterien der Patienten

Generalisierte aggressive Parodontitis (AP, n=73):
Erkrankungsbeginn vor dem 35. Lebensjahr
Attachmentverlust > 4mm an mindestens 30% der Zähne
> 3 betroffenen Zähne, keine Inzisivi oder erste Molaren
Missverhältnis zwischen Menge mineralisierter Plaque und Attachmentverlust

Generalisierte chronische Parodontitis (CP, n=60):
Attachmentverlust > 4mm an mindestens 30% der Zähne
Attachmentverlust konsistent zur Akkumulation mineralisierter Plaque

Kontrollprobanden ohne Parodontitis (n=80):
Sondiertiefe < 3.5mm
Kein Attachmentverlust durch Parodontitis (Ausnahmen: Attachmentverlust infolge überkonturierter Restaurationen, Putztraumata)

Genomische Untersuchungen

DNA-Isolation
Die DNA-Präparation der genomischen DNA aus humanem venösen EDTA-Blut erfolgte mittels "blood extraction kit" (Quiagen, Hilden).
200µl EDTA-Blut wurden zur Zelllyse mit 20 µl Protease versetzt.
Nach der Zugabe von 200 µl Lysispuffer AL wurde die Probe 15 sec gevortext und für 10 min bei 56°C inkubiert.
200 µl Ethanol wurde zugegeben, der Ansatz gevortext und auf eine Säule (QIAamp Spin Column) gegeben.
Nach 2maligem Waschen (Puffer AW1 und AW2) der an die Säule gebundenen DNA wurde die DNA durch Zentrifugation getrocknet.
Die DNA wurde mit 200µl aqua dest. 5min inkubiert und von der Säule gelöst.
Subgingivale Bestimmung von 5 parodontpathogenen Leitkeimen

Probengewinnung und DNA-Isolation
Die Plaqueproben wurden mit sterilen Papierspitzen aus der tiefsten Tasche jedes Quadranten entnommen und gepoolt.
Die bakterielle DNA wurde mittels QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen, Hilden) isoliert.
Die Papierspitzen wurden mit 180 µl ATL-Puffer und 20 µl Pproteinase K für 10min bei 70°C inkubiert.
200 µl Lysispuffer Al wurde hinzugegeben und 5min bei 95°C inkubiert.
Der Ansatz (ohne Filterspitzen) wurde auf eine Säuöe (QIAamp Spin Column) pipettiert und 2 mal mit Puffer AW1 und AW2 gewaschen.
Die DNA wurde in 400µl AE-Puffer gelöst und bei -20°C gelagert.

PCR
Für die spezifische Amplifikation von Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermedia (Pi), Tannerella forsythensis (Tf) und Treponema denticola (Td) wurde der micro-Ident® test von HAIN-Diagnostik (Lifesience, Nehren) benutzt. Mastermix (Puffer, biotinylierte Primer, DNA als Positivkontrolle), 2U Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg), und 5 µl der isolierten bakteriellen DNA wurden gemixt.
PCR: 5 min 95°C; 10 Zyklen: 30 sec 95°C, 2 min 58°C; 20 Zyklen: 25 sec 95°C, 40 sec 53°C, 40 sec 70°C; 8 min 70°C
Die PCR-Produkte wurden im ethidiumbromidhaltigen 1%igen Agarosegel aufgetrennt.

Hybridisierung
20 µl des PCR-Produkts und 20 µl der Denaturierungslösung wurden für 5 min inkubiert.
1 ml Hybridisierungspuffer (vorgewärmt auf 45°C) wurde dazugegeben.
Gabe dieser Lösung zur Membran, vorhybridisiert mit bakterieller DNA und Positivkontrollen.
Inkubation bei 45°C für 30 min im Schüttelwasserbad.
Membran wurde mit 1 ml "stringent wash solution" bei 45°C für 15 min gewaschen.
1 ml der Konjugatlösung wurde hinzugegeben (Raumtemp., 30 min).
Waschen der Membran und Inkubation mit 1 ml der Substratlösung.
Nachweis der Bakterien erfolgte visuell (Farbreaktion mittels Alkalischer Phosphatase).
2 Positivkontrollen für PCR (AC) und Hybridisierung (CC) sind im Test enthalten.

Abb. 3 und 4: Genotypisierung mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analysen
Abb. 5: Genotypisierung mittels Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analysen
 
Abb. 6: Subgingivale Bestimmung von 5 parodontpathogenen Leitkeimen (HAIN-Lifescience, Nehren)

Ergebnisse

Charakterisierung der Probanden
Keine signifikanten Unterschiede bezüglich Alter, Geschlecht und Raucherstatus (Patienten vs. Gesunde). Wie erwartet zeigen beide Patientengruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant schwerere klinische Symptome. Wie erwartet besitzen Patienten mit Parodontitis eine höhere subgingivale Belastung mit parodontpathogenen Keimen, aber: Nachweis von Tf und Td in über 50% der Kontrollprobanden + fehlende Signifikanz im Nachweis von Aa bei CP ⇒ Hinweis auf weitere regulierende, z. B. genetische Faktoren.

Klinische und demographische Charakterisierung
  Chronische Parodontitis Aggressive Parodontitis Gesunde Probanden p-Werte vs. Gesunde
  n = 60 n = 73 n = 80 CP AP
Alter (Jahre ± SD) 48.3 ± 10 41.4 ± 9.9 43.8 ± 11 n. s. n. s.
Geschlecht (% Männer) 31.4 38.3 41.5 n. s. n. s.
Nichtraucher (%) 67.9 58 70 n. s. n. s.
Approximaler Plaque index (%) 59.8 ± 26.2 53.8 ± 29.4 42.8 ± 18.9 < 0.001 0.023
Blutung nach Sondierung (%) 68.1 ± 25 78.1 ± 23.7 44.8 ± 24.4 < 0.001 < 0.001
Mittelwert Sondiertiefe (mm ± SD) 5.1 ± 1.1 6.5 ± 5.7 2.7 ± 0.9 < 0.001 < 0.001
Mittelwert der Sondiertiefe an den mikrobiologischen Teststellen
(mm ± SD)
6.7 ± 1.4 7.5 ± 1.6 3.1 ± 0.3 < 0.001 < 0.001
Mittelwert Attachmentverlust
(mm ± SD)
5.8 ± 1.4 6.6 ± 1.6 3 ± 1 < 0.001 < 0.001
Mittelwert Attachmentverlust an den mikrobiologischen Teststellen
(mm ± SD)
7.4 ± 1.7 8.5 ± 1.8 3.3 ± 0.5 < 0.001 < 0.001
Tab. 1: Klinische und demographische Charakterisierung der Probanden
 
Mikrobiologische Untersuchung
Aggregatibacter actinomycetemcomitans (%) 26.9 42 16 n. s. 0.002
Porphyromonas gingivalis (%) 86.5 79.7 16 < 0.001 < 0.001
Prevotella intermedia (%) 61.5 65.2 26 < 0.001 < 0.001
Tannerella forsythensis (%) 96.2 87 58 < 0.001 < 0.001
Treponema denticola (%) 98.1 87 64 < 0.001 0.003
Pg, Td, Tf (%) 80.8 72.5 16 < 0.001 < 0.001
Tab. 2: Mikrobiologische Charakterisierung der Probanden
 

Genomische Untersuchungen
Mittels binärer logistischer Regression wurde überprüft, ob der CD14 Genotyp auch bei Berücksichtigung weiterer Kofaktoren als unabhängiger Risikofaktor für die subgingivale Besiedlung mit P. intermedia bestätigt werden kann.
Nach Adjustierung für die Kofaktoren Alter, Geschlecht, Nikotinkonsum und klinischen Attachmentverlust an den mikrobiologischen Entnahmestellen konnte gezeigt werden, dass bei Trägern des CD14 Genotyp TT signifikant seltener P. intermedia nachzuweisen ist (p=0.017, OR=0.31, 95% CI=0.12-0.81).

Risikoanalyse (Besiedlung mit P. intermedia): Binäre logistische Regression*
Signifikante Variablen Regressionskoeffizient Standardfehler p-Wert Odds Ratio 95% CI
männl. Geschlecht 1.1 0.42 0.010 2.99 1.3-6.9
Genotyp TT 1.18 0.49 0.017 0.31 0.12.0.81
Tab. 3: Risikoanalyse
*Adjustierung für Alter, Geschlecht, Nikotinkonsum und CAL an mikrobiologischer Entnahmestelle
 
Abb. 7 und 8: Genomische Untersuchungen
 
Abb. 9: Genomische Untersuchungen
 
 

Schlußfolgerungen

Träger des homozygoten Genotyps TT des c.-159C>T-Polymorphismus im CD14-Gen zeigten im bivariaten Vergleich eine geringere Keimbelastung mit P. intermedia. Nach Adjustierung für Alter, Geschlecht, Nikotinkonsum und CAL an den mikrobiologischen Entnahmestellen konnte dieser Polymorphismus im multivariaten Modell als unabhängiger protektiver Faktor für die Keimbesiedlung mit P. intermedia bestätigt werden. Die Ergebnisse zeigten außerdem, dass die untersuchten genomischen Varianten in den Genen CD14 (c.-159C>T) und TLR4 (Asp299Gly, Thr399Ile) nicht zur Ausprägung einer schweren generalisierten aggressiven oder chronischen Parodontitis bei Patienten Mitteldeutschlands assoziiert werden können.
 

Dieses Poster wurde übermittelt von Dr. Susanne Schulz.
 

Korrespondenz-Adresse:
Dr. Susanne Schulz
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Universitätspoliklinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie
Harz 42a
06108 Halle, Germany