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Int Poster J Dent Oral Med 10 (2008), No. 2     15. June 2008

Int Poster J Dent Oral Med 2008, Vol 10 No 02, Poster 400

Der Promotorpolymorphismus c.-159C>T im CD14-Gen beeinflusst das Risiko für chronische Parodontitis

CD14 und chronische Parodontitis

Sprache: Deutsch

Autoren:
Dr. Susanne Schulz, Nico Zissler, Dr. Jana Klapproth, Dr. Uta Zimmermann, Prof. Hans-Günter Schaller, Dr. Stefan Reichert,
Universitätspoliklinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Christiane Gläser,
Institut für Humangenetik und Medizinische Biologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Dr. Helmut Machulla, Wolfgang Altermann,
Interdisziplinäres HLA-Labor Medizinische Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Datum/Veranstaltung/Ort:
28.09.2007-29.09.2007
Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Parodontologie 2007
Bonn
 

Einleitung

Als ein entscheidender Auslöser entzündlicher Parodontitiden wird die subgingivale Besiedlung mit parodontopathogenen Bakterien angesehen. Bei der nachfolgenden Immunantwort spielt CD14 als Rezeptor für bakterielle LPS-LBP-Komplexe eine wichtige Rolle. Es konnte gezeigt werden, dass die CD14-Produktion unter anderem von der individuellen genetischen Konstellation abhängt. Genomische Varianten von CD14, insbesondere im Promotorbereich des Gens, wurden mit einer veränderten Expression korreliert. Man kann vermuten, dass der genetische Background von CD14 durch seine Beeinflussung der CD14-Expression die Immunantwort auf subgingivale, bakterielle Keime steuert und damit bei der Ätiologie der Parodontitis eine wichtige Rolle spielen könnte.
 

Die Bedeutung des CD14-Rezeptors CD14-Genotypisierung: Elektrophoretische Auftrennung der DNA-Fragmente nach Restriktionsspaltung

Problemstellung

Ziel der Studie: In der vorliegenden Studie sollte ein möglicher Zusammenhang zwischen dem c.-159C>T-Promotorpolymorphismus und dem Auftreten von chronischer (CP) und/oder aggressiver (AP) Parodontitis untersucht werden.

Material und Methoden

Einschlusskriterien für Probanden

Generalisierte aggressive Parodontitis (AP):
Erkrankungsbeginn vor dem 35. Lebensjahr > 3 betroffenen Zähne, keine Inzisivi oder erste Molaren Missverhältnis zwischen Menge mineralisierter Plaque und Attachmentverlust

Generalisierte chronische Parodontitis (CP):
Attachmentverlust > 4mm an mindestens 30% der Zähne Attachmentverlust konsistent zur Akkumulation mineralisierter Plaque

Kontrollprobanden ohne Parodontitis:
Sondiertiefe < 3.5mm Kein Attachmentverlust durch Parodontitis (Ausnahmen: Pseudotaschen, überkonturierte Restaurationen)

Genomische Untersuchungen

DNA-Isolation

Die DNA-Präparation der genomischen DNA aus humanem venösen EDTA-Blut erfolgte mittels "blood extraction kit" (Quiagen, Hilden). 200µl EDTA-Blut wurden zur Zelllyse mit 20 µl Protease versetzt. Nach der Zugabe von 200 µl Lysispuffer AL wurde die Probe 15 sec gevortext und für 10 min bei 56°C inkubiert. 200 µl Ethanol wurde zugegeben, der Ansatz gevortext und auf eine Säule (QIAamp Spin Column) gegeben. Nach 2maligem Waschen (Puffer AW1 und AW2) der an die Säule gebundenen DNA wurde die DNA durch Zentrifugation getrocknet. Die DNA wurde mit 200µl aqua dest. 5min inkubiert und von der Säule gelöst.

Nachweis von 5 parodontalen Markerkeime mittels HAIN-Hybridisierung

PCR

PCR-Ansatz
1 µl Primer CD14-1 (10pmol/ µl) 5' GTG CCA ACA GAT GAG GTT CAC 3'
1 µl Primer CD14-2 (10pmol/ µl) 5' CAC TAG TCC CAA GTG TCT CCT CC 3'
12,5µl Master Mix (Promega, Madison, WI, USA)
0,25µl Formamid
1µl genomische DNA (50 ng/µl)
ad. 25 µl destilliertem Wasser
PCR-Programm
95°C 5 Minuten 1. Denaturierung
92°C 30 Sekunden Denaturierung 30 Zyklen
53°C 30 Sekunden Annealing
72°C 30 Sekunden Extension
delay 1 Sekunde
72°C 5 Minuten letzte Extension
4°C hold
PCR-Produkte wurden im ethidiumbromidhaltigen,2%igen Agarosegel aufgetrennt und ausgewertet.

Subgingivale Bestimmung von 5 parodontpathogenen Leitkeimen

Probengewinnung und DNA-Isolation

  • Die Plaqueproben wurden mit sterilen Papierspitzen aus der tiefsten Tasche jedes Quadranten entnommen und gepoolt.
  • Die bakterielle DNA wurde mittels QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen, Hilden) isoliert.
  • Die Papierspitzen wurden mit 180 µl ATL-Puffer und 20 µl Pproteinase K für 10min bei 70°C inkubiert.
  • 200 µl Lysispuffer Al wurde hinzugegeben und 5min bei 95°C inkubiert.
  • Der Ansatz (ohne Filterspitzen) wurde auf eine Säuöe (QIAamp Spin Column) pipettiert und 2 mal mit Puffer AW1 und AW2 gewaschen.
  • Die DNA wurde in 400µl AE-Puffer gelöst und bei -20°C gelagert.

PCR

  • Für die spezifische Amplifikation von Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Porphyromonas gingivalis (Pg), Prevotella intermedia (Pi), Tannerella forsythensis (Tf) und Treponema denticola (Td) wurde der micro-Ident® test von HAIN-Diagnostik (Lifesience, Nehren) benutzt. Mastermix (Puffer, biotinylierte Primer, DNA als Positivkontrolle), 2U Taq-Polymerase (Eppendorf, Hamburg), und 5 µl der isolierten bakteriellen DNA wurden gemixt.
  • PCR: 5 min 95°C; 10 Zyklen: 30 sec 95°C, 2 min 58°C; 20 Zyklen: 25 sec 95°C, 40 sec 53°C, 40 sec 70°C; 8 min 70°C
  • Die PCR-Produkte wurden im ethidiumbromidhaltigen 1%igen Agarosegel aufgetrennt.

Hybridisierung

  • 20 µl des PCR-Produkts und 20 µl der Denaturierungslösung wurden für 5 min inkubiert.
  • 1 ml Hybridisierungspuffer (vorgewärmt auf 45°C) wurde dazugegeben
  • Gabe dieser Lösung zur Membran, vorhybridisiert mit bakterieller DNA und Positivkontrollen.
  • Inkubation bei 45°C für 30 min im Schüttelwasserbad.
  • Membran wurde mit 1 ml "stringent wash solution" bei 45°C für 15 min gewaschen.
  • 1 ml der Konjugatlösung wurde hinzugegeben (Raumtemp., 30 min).
  • Waschen der Membran und Inkubation mit 1 ml der Substratlösung.
  • Nachweis der Bakterien erfolgte visuell (Farbreaktion mittels Alkalischer Phosphatase).
  • 2 Positivkontrollen (PCR (AC) und Hybridisierung (CC)) sind im Test enthalten.


Ergebnisse

Charakterisierung der Patientengruppen

Klinische und demographische Charakterisierung
  Chronische

Parodontitis

Aggressive

Parodontitis

Gesunde

Probanden

p-Werte

vs. Gesunde

  n = 51 n = 60 n = 41 CP AP
Alter (Jahre±SD) 48.3±10 41.4±9.9 43.8±11 n.s. n.s.
Geschlecht (% Männer) 31.4 38.3 41.5 n.s. n.s.
Nichtraucher (%) 67.9 58 70 n.s. n.s.
Approximaler Plaque Index (%) 59.8±26.2 53.8±29.4 42.8±18.9 <0.001 0.023
Blutung nach Sondierung (%) 68.1±25 78.1±23.7 44.8±24.4 <0.001 <0.001
Mittelwert Sondertiefe (mm±SD) 5.1±1.1 6.5±5.7 2.7±0.9 <0.001 <0.001
Mittelwert der Sondiertiefe an den

mikrobiologischen Teststellen (mm±SD)

6.7±1.4 7.5±1.6 3.1±0.3 <0.001 <0.001
Mittelwert Attachmentverlust (mm±SD) 5.8±1.4 6.6±1.6 3±1 <0.001 <0.001
Mittelwert Attachmentverlust an den

mikrobiologischen Teststellen (mm±SD)

7.4±1.7 8.5±1.8 3.3±0.5 <0.001 <0.001
 

Mikrobiologische Untersuchung
Actinbacillus actinomycetemcomitans (%) 26.9 42 16 n.s. 0.002
Porphyromonas gingivalis (%) 86.5 79.7 16 <0.001 <0.001
Prevotella intermedia (%) 61.5 65.2 26 <0.001 <0.001
Tanerella forsythensis (%) 96.2 87 58 <0.001 <0.001
Treponema denticola (%) 98.1 87 64 <0.001 0.003
Pg, Td, Tf (%) 80.8 72.5 16 <0.001 <0.001

Keine signifikanten Unterschiede bezüglich Alter, Geschlecht und Raucherstatus (Patienten vs. Gesunde) Wie erwartet zeigen beide Patientengruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant schwerere klinische Symptome. Wie erwartet besitzen Patienten mit Parodontitis eine höhere subgingivale Belastung mit parodontpathogenen Keimen Aber: Nachweis von Tf und Td in über 50% der Kontrollprobanden + fehlende Signifikanz im Nachweis von Aa bei CP  Hinweis auf weitere regulierende, z.B. genetische Faktoren

Genetische Untersuchungen

Die Genotypverteilung der parodontal Gesunden entsprach dem Hardy-Weinberg-Gesetz. Im bivariaten Vergleich der Genotypfrequenzen wurde für homozygote Genotyp-träger (CC und TT) eine 1.6fach erhöhte Odds ratio für chronische Parodontitis bestimmt (p=0.034, 95% CI=1.01-2.56) Mittels binärer logistischer Regression wurde überprüft, ob der CD14 Genotyp auch bei Berücksichtigung weiterer Kofaktoren für Parodontitis als unabhängiger Risikofaktor bestätigt werden kann. Nach Adjustierung für die Kofaktoren Alter, Geschlecht, Nikotinkonsum und API konnte für Patienten mit chronischer Parodontitis gezeigt werden, dass der CD14 Genotyp CC+TT das Erkrankungsrisiko signifikant erhöht (p=0.015, OR=3.6, 95% CI=1.28-9.88).

Genotypverteilung des CD14-Polymorphismus c.-159C>T

Risikoanalyse (CP vs. Gesunde): Binäre logistische Regression*
Signifikante
Variablen
Regressions-
koeffizient
Standard-
fehler
p-Wert Odds
ratio
95% CI
API 0.04 0.01 0.011 1.04 1.02-1.06
Genotyp CC+TT 1.27 0.52 0.015 3.6 1.28-9.88
*Adjustierung für Alter, Geschlecht, Nikotinkonsum und API
Multivariate Risikoanalyse für die Genotypen CC und TT des CD14 SNPs c.-159C>T

Schlußfolgerungen

Die Ergebnisse lassen vermuten, dass Träger der homozygoten Genotypen CC und TT ein erhöhtes Erkrankungsrisiko für chronischer Parodontitis tragen. Träger des heterozygoten Genotyps CT, die entsprechend der Literaturdaten durch eine balancierte CD14-Expression charakterisiert werden können, sind möglicherweise durch ihre damit verbundene moderate Immunantwort besser in der Lage, auf parodontopathogene Keime zu reagieren.



Dieses Poster wurde übermittelt von Dr. Susanne Schulz.

Korrespondenz-Adresse:
Dr. Susanne Schulz
Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Universitätspoliklinik für Zahnerhaltungskunde und Parodontologie
Harz 42
D-06097 Halle