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Int Poster J Dent Oral Med 3 (2001), No. 1     15. Mar. 2001

Int Poster J Dent Oral Med 2001, Vol 3 No 1, Poster 69

Quantitative REM-Untersuchung zur Biofilmbildung auf Titanoberflächen

Sprache: Deutsch

Autoren: Volker Braasch, Inge Schmitz, Klaus-Michael Müller, Wolf-Dieter Grimm
Universität Witten/Herdecke, ZMK, Abt. für Parodontologie; Universitätsklinik Bergmannsheil Bochum, Institut für Pathologie, Germany

Datum/Veranstaltung/Ort: 
16.11.2000-18.11.2000
124. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde (DGZMK) gemeinsam mit der Deutschen Gesellschaft für Parodontologie und der Landeszahnärztekammer Hessen, Colgate-Forschungspreis 2000 der DGZMK
Frankfurt am Main, Germany


Colgate Forschungspreis 2000

Einleitung

Das Ziel der vorliegenden Untersuchung bestand darin, verschiedene Ti-Oberflächen mit elektronenoptischen und elektronenspektroskopischen Methoden zu charakterisieren und deren Einfluss auf die frühe subgingivale bakterielle Adhärenz in vivo zu quantifizieren. Die zu untersuchenden Titanoberflächen wurden als kronenähnlichen Prüfkörper mittels Procera™ -Technik (Cp) und Dentaurum-Gusstechnologie (Re) entsprechend den Anforderungen der REM-Analyse gestaltet und hergestellt. Die quantitative Bewertung der subgingivalen Biofilmbildung auf den Titanprüfkörpern erfolgte nach 6, 12 und 24 stündiger intraoraler Exposition. Sie wurde mit Hilfe des Computerprogramms Scion Image for Windows durchgeführt. Die Anzahl der Partikel war bei allen drei Expositionszeiten in der Re-Prüfkörpergruppe größer als in der Cp-Prüfkörpergruppe.Ursächlich verantwortlich für die trotz höherer Rauhigkeitswerte signifikant (Mann-Whitney-U-Test, a = 0,05) verminderte subgingivale initiale bakterielle Adhärenz auf den hochglanzpolierten, gefrästen Titanprüfkörpern (Cp) könnten die mittels MIES (Metastable Induced Electron Spectroscopy) nachgewiesenen CH2-Gruppen sein. Diese inhibitorisch wirkenden CH2-Gruppen waren der äußeren Schicht aufgelagert und auf den gegossenen Ti-Oberflächen (Re) nicht zu identifizieren.

Material und Methoden

REM-Untersuchungen der Titanprüfkörper:
Prüfkörper (Abb.1, 2):

  • gegossene Titanprüfkörper (Re1, Re2, Re3), Dentaurum-Technik aus rema-Titan (cp-Titan Grad 1)
  • gefräste Prüfkörper (Cp1, Cp2, Cp3), Procera-Technik aus cp-Titan Grad 2.
  • erreichte Endpoliturstufe entspricht einer zeitunabhängigen Maximalpolitur

Charakterisierung der Mikromorphologie:

  • Rasterelektronenmikroskop DSM 940 der Firma Zeiss
    • bei 20 kV, Prüfkörperdetektorenabstand ca. 25 mm
    • Neigungswinkel der Prüfkörperoberfläche von 30°
    • Sterilisation im Autoklaven
    • zu untersuchende Areale: subgingivaler Randbereich der kronenförmigenTi-Prüfkörper
    • Mikrofotographie bei den Vergrößerungen 500x, 1000x und 2000
  • EDX-Analyse mit AN 10/25S Link Analytical (Oxford)

Abb. 1: Titanprüfkörper Cp und Re mit speziellem Design Abb. 2: Präparierte Titanprüfkörper für REM-Untersuchung


Quantitative in vivo-Untersuchung zur initialen subgingivalen Adhärenz

  • Reinigung der Titanprüfkörper mit 70%igem Ethanol im Ultraschallbad für 5 min, Luft trocknung, in Sterilfolie eingeschweißt, Sterilisation im Autoklaven intraorale Exposition von jeweils 6, 12 und 24 (t1, t2, t3) h an Zähne 31, 32
  • Fixierung in 2,5%iger Glutaraldehydlösung
  • Dehydrierung der an den Titanprüfkörpern anhaftenden Adsorbaten in aufsteigender Alkoholreihe für jeweils 15 min
  • dreimaliges Waschen (0,05-M-Phosphatpufferlösung,, pH = 7,4, je 10 min)
  • critical point-Trocknung CPD 030 [Blazers] und gold-sputtering (60nm) [Sputter Coater S 150 B (Edwards)]
  • Darstellung der Adsorbate auf vier planen Oberflächen (mesial, lingual, vestibulär, distal) aller Titanprüfkörper im subgingivalen Randbereich bei Vergrößerung 100x, 1000x und 2000x
  • Mikrofotografie mit Contax-Kamera auf Ilford PanF 50/135 SW Negativfilmen
  • Quantitative Auswertung der fotografischen Abzüge (Ilford Mulitgrade IV RC de luxe) der Vergr. 1000x
  • quantitative Bewertung der Adsorbate erfolgte mit Hilfe der Software Scion Image for Windows (Scion Corporation, Maryland, USA).

Die REM-Aufnahmen der Prüfkörperoberflächen zum Zeitpunkt t0 wurden für die Kalibrierung des Schwellenwertes herangezogen. Ein Areal von 1 µm2 besteht bei einer Auflösung von 150 dpi aus rund 48 Bildpunkten. Für die Partikelanalyse wurde dieses Areal als untere Grenze einer zu analysierenden Partikelgröße angegeben. Die maximale Anzahl an Bildpunkten lag programmbedingt bei 999.999. (Abb. 3) Dies entspricht bei einer Auflösung von 150 dpi einer Fläche von rund 147,06 x 147,06 µm. Die Partikelanalyse einer jeden Aufnahme bestand in der fünfmaligen Vermessung einer 30 x 30 µm großen Fläche (Meßquadrat) innerhalb des gesamten Bildausschnittes. Das die Partikel eingrenzende Meßquadrat wurde über fünf verschiedene, zufällig ausgewählte Regionen des ca. 8.084 µm2 großen Bildausschnittes gelegt. (Abb. 4) Die zufällige Auswahl der Regionen erfolgte mit Hilfe eines Rasters, das das REM-Bild in sechs gleichgroße und numerierte Areale teilte. Durch das Zufallsprinzip wurde bei jeder Aufnahme fünfmal und unmittelbar vor jeder Messung ein Untersuchungsareal festgelegt. Danach erfolgte die Kalibrierung des Schwellenwertes zur Ausblendung des Hintergrundes bzw. der Materialoberfläche. Durch das Programm wurde dann diese binäre Darstellung des REM-Bildes auf Höhe des Meßquadrates in der gesamten Bildbreite gescannt. (Abb. 5, 6)
Die Auswertung der mit PC-IMAGE for Windows durchgeführten Partikel-Analyse auf subgingival gelegenen Titanoberflächen der Prüfkörper Re1-3 und Cp1-3 erfolgte mit der Software Excel 7.0 sowie mit der Statistik-Software SPSS 8.0 for Windows.

Abb. 3: Kalibrierung der Meßfunktion Abb. 4: Kalibrierung des Meßquadrates (30x30 µm)


Abb. 5: Binäre Darstellung mit ausgeblendeter Prüfkörperoberfläche Abb. 6: Gescannter Bildbereich des Meßquadrates


Ergebnisse

Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen der mit der Procera-Technik hergestellten Ti-Prüfkörper Cp1-3 zeigten deutliche Spuren der maschinellen Bearbeitung. Der Verlauf, die Dichte, die Breite und Tiefe dieser Schleifrillen waren unterschiedlich. Weiterhin zeigten sich schollenartige Metallpartikel und kleine runde Vertiefungen. Charakteristisch für die Oberflächenmorphologie der mit der Dentaurum-Technik gegossenen Titanprüfkörper Re1-3 war ein sehr schmaler, morphologisch irregulärer Randbereich, der in eine elektronenmikroskopisch glatte Oberfläche überging. Dieser ca. 30 bis 50 µm breite Randbereich zeigte unregelmäßige Zerklüftungen. (Abb. 7) Die Anzahl, die Summe und der maximale Wert der gemessenen Partikel auf den subgingival gelegenen Titanprüf-körperoberflächen der gemessenen Partikelflächen war bei allen drei Re-Prüfkörpern deutlich größer als bei den für die gleiche Zeit intraoral exponierten Cp-Prüfkörpern. (Abb. 9, 10) Der berechnete Median der Partikelfläche auf den einzelnen Prüfkörpern bewegte sich von 1,84 µm2 bis 2,72 µm2. Aus dieser Nichtnormalverteilung ergibt sich die Notwendigkeit der Anwendung von nichtparametrischen Testverfahren. Der Vergleich (Mann-Whitney-U-Test) der beiden Ti-Prüfkörpergruppen bezüglich der ermittelten Partikelflächen nach den einzelnen intraoralen Expositionszeiten zeigte für die Re-Prüfkörpern signifikant (a = 0,05) größere Werte.(Abb. 10)

Abb. 7: REM der subgingivalen Prüfkörperrandbereiche (Cp, Re) Abb. 8: REM der subgingivalen Prüfkörperrandbereiche (Cp, Re) nach intraoraler Exposition (6, 12, 24 h)


EDX-Analyse
Cp-Titanprüfkörper, Re-Titanprüfkörper


Abb. 9: Anzahl der gemessenen Partikel Abb. 10: Summe der gemessenen Partikelflächen


Diskussion und Schlussfolgerungen

Wir konnten feststellen, dass nach einer intraoralen Expositionszeit von sechs Stunden die Oberflächen beider Titanprüfkörper (Cp1 und Re1) adhärente rundliche und ovale Morphotypen von Bakterien aufweisen, die mit der Oberfläche durch fortsatzartige Strukturen verbunden und den Streptokokken zuzuordnen sind. Nach einer Expositionszeit von 24 Stunden zeigte sich auf beiden Prüfkörperoberflächen eine dichte Bakterienflora bestehend aus unterschiedlichen langen und kurzen stäbchenförmigen und filamentartigen Morphotypen. Im Vergleich der beiden Untersuchungsgruppen erscheint die bakterielle Besiedlung der Re-Prüfkörperoberfläche kompakter. In einer Untersuchung unserer Arbeitsgruppe konnte mit einem speziellen Spektroskopieverfahren, der Metastable Impact Elektron Spectroscopy (MIES), die chemische Beschaffenheit der obersten, auf der Titanoxidschicht befindlichen Adsorbatschicht unbehandelter Titanoberflächen untersucht werden. Hierbei stellte sich ein der Titanoxidschicht aufgelagerter, aus CH2-Gruppen bestehender Verunreinigungsfilm dar. Diese Oberflächenveränderungen führen offensichtlich zu einer selektiven Adsorption spezifischer Speichelproteine wie Steinberg et al. (1998) in einer in vitro-Untersuchungen nachweisen konnten. Dies führen wir auf die nachgewiesenen CH2Gruppen zurück. Die inhibitorisch wirkenden CH2-Gruppen waren der äußeren Ti02-Schicht aufgelagert und auf den gegossenen Titanoberflächen nicht zu identifizieren. Damit muß der Textur von Ti-Oberflächen eine entscheidende Rolle bei der materialspezifischen Adsorption von Biopolymeren und die dadurch beeinflußte initiale bakterielle Adhärenz auf Titanoberflächen eingeräumt werden. Differenzen in der molekularen Zusammensetzung der Proteinschichten, in der Menge der adsorbierten Proteine, im zeitlichen Ablauf des Adsorptionsprozesses der unterschiedlichen Proteine sowie in der Struktur der Proteinschichten sind somit mögliche Folgen eines substratinduzierten Transfers von Oberflächeneigenschaften in die Pellikelschichten. Demnach wäre eine spezifische Pellikelzusammensetzung Ausdruck einer oberflächenspezifischen Adsorption selektiver Makromoleküle aus dem Speichel, die die Oberflächentextur der adsorbierenden Festkörperoberflächen widerspiegelt.

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This Poster was submitted on 09.02.01 by Professor Wolf-Dieter Grimm.

Correspondence address:
Prof. Wolf-Dieter Grimm
Universität Witten/Herdecke
Alfred Herrhausen Straße 50
58448 Witten
Tel.: (02302) 926-668